DNA-amplificatie door middel van polymerasekettingreactie

PCR betekent polymerasekettingreactie, een moleculair-biologische techniek voor het versterken van DNA-segmenten, door onder gecontroleerde omstandigheden meerdere kopieën te genereren met DNA-polymerase-enzymen. Slechts een enkele kopie van een DNA-segment of gen kan in miljoenen kopieën worden gekloond, waardoor detectie met behulp van kleurstoffen en andere visualisatietechnieken mogelijk is.

Het proces van PCR, ontwikkeld in 1983, heeft het mogelijk gemaakt om te presteren DNA sequentie en de volgorde van nucleotiden in individuele genen identificeren. De methode maakt gebruik van thermische cycli of het herhaald verwarmen en koelen van de reactie voor het smelten en repliceren van DNA. Terwijl de PCR doorgaat, wordt het "nieuwe" DNA gebruikt als een sjabloon voor replicatie en volgt er een kettingreactie, waardoor de DNA-sjabloon exponentieel wordt versterkt.

PCR-technieken worden op veel gebieden van de biotechnologie toegepast, waaronder proteïne engineering, klonen, forensisch onderzoek (DNA-vingerafdrukken), vaderschapstests, de diagnose van erfelijke en / of infectieziekten, en voor de

Met name in de forensische geneeskunde is PCR bijzonder nuttig omdat het zelfs de kleinste hoeveelheid DNA-bewijs versterkt. PCR kan ook worden gebruikt om DNA te analyseren dat duizenden jaren oud is, en deze technieken zijn gebruikt om alles te identificeren, van een 800.000 jaar oude mammoet tot mummies van over de hele wereld.

Deze stap is alleen nodig voor DNA-polymerasen die hot-start PCR vereisen. De reactie wordt verwarmd tot tussen 94 en 96 ° C en wordt gedurende 1-9 minuten vastgehouden.

Als de procedure geen initialisatie vereist, is denaturatie de eerste stap. De reactie wordt 20-30 seconden verwarmd tot 94-98 ° C. De waterstofbruggen van de DNA-sjabloon worden verbroken en er ontstaan ​​enkelstrengige DNA-moleculen.

De reactietemperatuur is lager tot tussen 50 en 65 ° C en wordt 20-40 seconden vastgehouden. De primers hechten aan de enkelstrengs DNA-matrijs. Tijdens deze stap is de temperatuur uiterst belangrijk. Als het te warm is, kan de primer mogelijk niet binden. Als het te koud is, kan de primer niet goed hechten. Een goede binding wordt gevormd wanneer de primersequentie nauw overeenkomt met de templatesequentie.

De temperatuur tijdens deze stap varieert afhankelijk van het type polymerase. Het DNA-polymerase synthetiseert een volledig nieuwe DNA-streng.

Deze stap wordt 5-15 minuten na de laatste PCR-cyclus bij 70-74 ° C uitgevoerd.

Deze stap is optioneel. De temperatuur wordt op 4-15 ° C gehouden en stopt de reactie.

Tijdens elke cyclus wordt het product (het specifieke stuk DNA dat wordt gerepliceerd) verdubbeld.

Als het DNA-polymerase activiteit verliest en reagentia verbruikt, vertraagt ​​de reactie.

Er verzamelt zich geen product meer.