De twee centrale personages in Van muizen en mannen zijn George Milton en Lennie Small, twee migrerende veldwerkers die in de jaren dertig op zoek waren naar werk op de boerderij in Zuid-Californië. Als het boek begint, zijn George en Lennie net op een nieuwe ranch aangekomen; daar ontmoeten George en Lennie - en via hen de lezers - een fascinerende cast van personages.
Lennie Small
Lennie Small is een grote, zachtaardige migrerende werknemer met een verstandelijke beperking. Hij vertrouwt op George Milton, zijn levenslange vriend en collega-migrerende werknemer, voor begeleiding en veiligheid. In aanwezigheid van George, Lennie verdedigt tegen zijn gezaghebbende vriend, maar wanneer George er niet is, spreekt Lennie vrijer. Soms laat hij informatie achter die George hem vertelde geheim te houden, zoals hun plan om een stuk grond te kopen.
Lennie houdt ervan om alles wat zacht is aan te raken, van stof tot de vacht van een muis tot het haar van een vrouw. Hij is een klassieke, zachte reus, die nooit schade probeert te veroorzaken, maar zijn fysieke kracht leidt onbedoeld tot vernietiging. We leren van George dat hij en Lennie hun laatste boerderij moesten verlaten omdat Lennie het niet kon nalaten de jurk van een vrouw aan te raken en werd uiteindelijk beschuldigd van verkrachting. Als Lennie een puppy cadeau krijgt van een van de andere veldwerkers, doodt hij hem per ongeluk door hem te sterk te aaien. Het onvermogen van Lennie om zijn fysieke kracht te beteugelen, leidt tot problemen voor beide mannen, met name wanneer hij per ongeluk Curley's vrouw vermoordt.
George Milton
George Milton is zowel een dominante leider als een loyale beschermer van Lennie. De twee mannen zijn samen opgegroeid, maar George oefent meer autoriteit uit in de vriendschap vanwege Lennie's afhankelijkheid.
George en Lennie praten vaak over het krijgen van hun eigen land. Lennie lijkt dit plan zeer serieus te nemen, maar de inzet van George is minder duidelijk. Bijvoorbeeld, in plaats van geld te sparen om in de toekomst land te kopen, blaast George zijn spaargeld in één nacht op terwijl hij carrouselt aan een bar.
George klaagt soms over zijn zorgzame rol, maar hij is duidelijk toegewijd om op Lennie te letten. Zijn redenering wordt echter nooit duidelijk uitgelegd. Het kan zijn dat George bij Lennie blijft omdat de relatie hem een gevoel van autoriteit geeft wanneer zijn leven anders aan zelfbeschikking ontbreekt. Hij troost zich waarschijnlijk ook in de bekendheid van Lennie, aangezien de twee mannen regelmatig reizen en nooit ergens een claim claimen.
Nadat Lennie per ongeluk de vrouw van Curley heeft vermoord, kiest George ervoor om Lennie te vermoorden. De beslissing is een daad van barmhartigheid om zijn vriend te behoeden voor het lijden van de andere veldwerkers.
Curley
Curley is de agressieve, kortstondige zoon van de rancheigenaar. Hij loopt gezag rond de boerderij en het gerucht gaat dat hij een voormalige bokshandschoen van Golden Gloves is. Curley kiest constant gevechten, vooral met Lennie; zo'n gevecht leidt ertoe dat Lennie Curley's hand verplettert.
Curley draagt te allen tijde een handschoen aan een van zijn handen. De andere arbeiders beweren dat de handschoen gevuld is met lotion om zijn hand fijn te houden voor zijn vrouw. Curley is in feite erg jaloers en beschermend voor zijn vrouw, en hij is vaak bang dat ze met de andere arbeiders flirt. Nadat Lennie per ongeluk de vrouw van Curley heeft vermoord, leidt Curley de andere arbeiders op een moorddadige jacht op de nieuwkomer.
Snoep
Candy is een ouder wordende klusjesman die jaren geleden een van zijn handen verloor bij een ongeluk. Als gevolg van zowel zijn handicap als zijn leeftijd maakt Candy zich zorgen over zijn toekomst op de boerderij. Wanneer Lennie onthult dat hij en George van plan zijn hun eigen land te kopen, voelt Candy dat hij geluk heeft gehad en biedt hij $ 350 aan om zich bij hen aan te sluiten. Candy gelooft, net als Lennie, oprecht in dit plan, en als gevolg daarvan staat hij sympathiek tegenover George en Lennie door de hele novelle heen, zelfs om George te helpen de jacht op Lennie uit te stellen na de vrouw van Curley dood.
Oplichters
Crooks, die zijn bijnaam kreeg vanwege zijn misvormde rug, is een stabiele hand en de enige Afro-Amerikaanse arbeider op de ranch. Vanwege zijn ras mag Crooks niet samen met de andere arbeiders in de schuur wonen. Crooks is bitter en cynisch, maar kan toch goed overweg met Lennie, die het racisme van de andere arbeiders niet deelt.
Hoewel George hem tot geheimhouding heeft gezworen, vertelt Lennie Crooks dat hij en George van plan zijn land te kopen. Crooks is diep sceptisch. Hij vertelt Lennie dat hij allerlei mensen over allerlei plannen heeft horen praten, maar dat geen van hen ooit echt is gebeurd.
Later in dezelfde scène benadert Curley's vrouw de twee mannen, flirterend babbelend. Wanneer Crooks haar vraagt te vertrekken, gooit Curley's vrouw raciale scheldwoorden naar hem en zegt dat ze hem kan laten lynchen. Het incident is vernederend voor Crooks, die zich vervolgens moet verontschuldigen voor de vrouw van Curley voor Lennie en Candy, ondanks dat hij de onrechtmatige partij is.
Curley's vrouw
Curley's vrouw is een jonge, mooie vrouw wiens naam nooit in de novelle wordt genoemd. Haar man, Curley, is jaloers en wantrouwend en hij snauwt vaak naar haar. Ze heeft een lieve kant, wat ze laat zien als ze Lennie vertelt over haar jeugddromen over filmsterrendom, evenals een wrede streak, zoals blijkt uit de racistische verbale aanval die ze lanceert bij Crooks. Curley's vrouw versnelt de climax van het boek door Lennie te vragen haar haar te aaien, waarna Lennie haar per ongeluk doodt. Curley's vrouw is minder ontwikkeld dan andere personages en ze lijkt vooral te dienen om het complot vooruit te helpen en conflicten aan te wakkeren.