Het veld van biotechnologie is er een van constante verandering. De snelle groei en ontwikkeling van baanbrekend onderzoek zijn afhankelijk van de innovatie en creativiteit van wetenschappers en hun vermogen om het potentieel in een moleculaire basistechniek te zien en toe te passen op nieuwe processen. De komst van polymerase kettingreactie (PCR) opende veel deuren in genetisch onderzoek, waaronder een middel DNA-analyse en identificatie van verschillende genen op basis van hun DNA-sequenties. DNA-sequentiebepaling is ook afhankelijk van ons vermogen om te gebruiken gel elektroforese om DNA-strengen te scheiden die in grootte verschillen met slechts één basenpaar.
DNA sequentie
Eind jaren zeventig werden twee DNA-sequentietechnieken voor langere DNA-moleculen uitgevonden: de Sanger-methode (of dideoxy) en de Maxam-Gilbert-methode (chemische splitsing). De Maxam-Gilbert-methode is gebaseerd op nucleotidespecifieke splitsing door chemicaliën en wordt het best gebruikt om oligonucleotiden te sequencen (korte nucleotidepolymeren, gewoonlijk kleiner dan 50 basenparen lang). De Sanger-methode wordt vaker gebruikt omdat is bewezen dat het technisch eenvoudiger is om toe te passen, en met de komst van PCR en automatisering van de techniek, is gemakkelijk toe te passen op lange DNA-strengen, waaronder enkele hele genen. Deze techniek is gebaseerd op ketenbeëindiging door dideoxynucleotiden tijdens PCR-verlengingsreacties.
Sanger-methode
In de Sanger-methode wordt de te analyseren DNA-streng gebruikt als matrijs en wordt DNA-polymerase gebruikt in een PCR-reactie om complementaire strengen te genereren met behulp van primers. Er worden vier verschillende PCR-reactiemengsels bereid, die elk een bepaald percentage dideoxynucleosidetrifosfaat (ddNTP) analogen bevatten met een van de vier nucleotiden (ATP, CTP, GTP of TTP).
De synthese van de nieuwe DNA-streng gaat door totdat een van deze analogen is opgenomen, waarna de streng voortijdig wordt afgeknot. Elke PCR-reactie zal uiteindelijk een mengsel van verschillende lengtes DNA-strengen bevatten, die allemaal eindigen op het nucleotide dat voor die reactie was gemerkt met dideoxy. Gel elektroforese wordt vervolgens gebruikt om de strengen van de vier reacties in vier afzonderlijke banen te scheiden en de volgorde van de oorspronkelijke sjabloon te bepalen op basis van de lengte van de strengen die eindigen met welk nucleotide.
In de geautomatiseerde Sanger-reactie worden primers gebruikt die zijn gelabeld met vier verschillende gekleurde fluorescerende tags. PCR-reacties, in aanwezigheid van de verschillende dideoxynucleotiden, worden uitgevoerd zoals hierboven beschreven. Vervolgens worden de vier reactiemengsels echter gecombineerd en op een enkele baan van een gel aangebracht. De kleur van elk fragment wordt gedetecteerd met een laserstraal en de informatie wordt verzameld door een computer die chromatogrammen genereert die pieken tonen voor elke kleur, waaruit de sjabloon-DNA-sequentie kan zijn vastbesloten.
Typisch is de geautomatiseerde sequentiemethode alleen nauwkeurig voor sequenties tot een maximum van ongeveer 700-800 basenparen lang. Het is echter mogelijk om volledige sequenties van grotere genen en in feite hele genomen te verkrijgen, met stapsgewijze methoden zoals Primer Walking en Shotgun-sequencing.
In Primer Walking wordt de sequentie bepaald van een werkbaar deel van een groter gen met behulp van de Sanger-methode. Nieuwe primers worden gegenereerd uit een betrouwbaar segment van de sequentie en gebruikt om de sequentie van het gedeelte van het gen voort te zetten dat buiten het bereik van de oorspronkelijke reacties viel.
Shotgun-sequentiebepaling houdt in dat het willekeurige DNA-segment willekeurig wordt geknipt tot meer geschikt (beheersbare) fragmenten op maat, waarbij elk fragment in volgorde wordt geplaatst en de stukken worden gerangschikt op basis van overlapping opeenvolgingen. Deze techniek is gemakkelijker gemaakt door het toepassen van computersoftware voor het rangschikken van de overlappende stukken.