TBE-buffer (Tris-boraat-EDTA) is een bufferoplossing bestaande uit Tris-base, boorzuur en EDTA (ethyleendiaminetetra-azijnzuur). Deze buffer wordt vaak gebruikt voor agarosegelelektroforese bij de analyse van DNA-producten die het resultaat zijn van PCR-amplificatie, DNA-zuiveringsprotocollen of DNA-kloneringsexperimenten.
TBE gebruikt
TBE-buffer is bijzonder nuttig voor de scheiding van kleinere DNA-fragmenten (MW <1000), zoals kleine producten van restrictie-enzym verteert. TBE heeft een grotere buffercapaciteit en geeft een scherpere resolutie dan TAE-buffer. TAE (Tris-acetaat-EDTA) buffer is een oplossing bestaande uit Tris-base, azijnzuur en EDTA.
TBE is over het algemeen duurder dan TAE en remt DNA-ligase, wat problemen kan veroorzaken als daaropvolgende DNA-zuiverings- en ligatiestappen zijn bedoeld. Met de drie eenvoudige stappen die volgen, leert u hoe u TBE-buffer kunt maken. Het duurt niet langer dan ongeveer 30 minuten om te maken.
Wat je nodig hebt
Om TBE-buffer te maken, hebt u slechts vier stoffen nodig. De resterende items op deze lijst zijn uitrusting. De vier vereiste stoffen zijn EDTA dinatriumzout, Tris-base, boorzuur en gedeïoniseerd water.
Wat betreft apparatuur, u hebt een pH-meter en kalibratiestandaarden nodig. Bovendien wilt u bekers of kolven van 600 milliliter en 1500 milliliter. Afronding van uw apparatuurbehoeften zijn maatcilinders, roerstaven en roerplaten.
Controleer de inventaris in het lab dat je gaat gebruiken om er zeker van te zijn dat je alles hebt wat je nodig hebt voordat je aan de slag gaat. Niets is erger dan halverwege een oplossing te moeten voorbereiden, omdat de juiste materialen opraken.
Als uw lab op school of op uw werkplek is, neemt u contact op met het juiste personeel om te zien of ze alle artikelen op voorraad hebben. Dit kan u uiteindelijk tijd en energie besparen.
Formulegewicht wordt afgekort als FW. Het is het atoomgewicht van een element vermenigvuldigd met het aantal atomen van elk element in een formule, waarna alle massa's van elk element bij elkaar worden opgeteld.
Voorraadoplossing van EDTA
Een EDTA-oplossing moet van tevoren worden voorbereid. EDTA zal niet volledig in de oplossing gaan totdat de pH is ingesteld op ongeveer 8,0. Weeg voor een voorraadoplossing van 500 milliliter van 0,5 M EDTA 93,05 gram EDTA dinatriumzout (FW = 372,2) af. Los het vervolgens op in 400 ml gedeïoniseerd water en pas de pH aan met NaOH (natriumhydroxide). Vul daarna de oplossing bij tot een eindvolume van 500 milliliter.
Voorraadoplossing van TBE
Maak een geconcentreerde (5x) stockoplossing van TBE door 54 gram Tris-base (FW = 121.14) en 27.5 te wegen gram boorzuur (FW = 61,83) en beide oplossen in ongeveer 900 ml gedeioniseerd water. Voeg vervolgens 20 ml 0,5 M (molariteit of de concentratie) EDTA (pH 8,0) toe en stel de oplossing in op een eindvolume van 1 liter. Deze oplossing kan bij kamertemperatuur worden bewaard, maar in oudere oplossingen zal zich een neerslag vormen. Bewaar de buffer in glazen flessen en gooi weg als zich een neerslag heeft gevormd.
Werkoplossing van TBE
Voor agarosegelelektroforese kan een TBE-buffer worden gebruikt in een concentratie van 0,5x (1:10 verdunning van de geconcentreerde voorraad). Verdun de stockoplossing 10x in gedeïoniseerd water. Uiteindelijke opgeloste stofconcentraties zijn 45 mM Tris-boraat en 1 mM (millimolair) EDTA. De buffer is nu klaar voor gebruik in een agarosegel uitvoeren.