Restrictie-endonucleasen zijn een klasse van enzym die DNA-moleculen snijden. Elk enzym herkent unieke sequenties van nucleotiden in een DNA-streng - gewoonlijk ongeveer vier tot zes basenparen lang. De sequenties zijn palindroom doordat de complementaire DNA-streng dezelfde sequentie in omgekeerde richting heeft. Met andere woorden, beide DNA-strengen worden op dezelfde locatie doorgesneden.
Waar deze enzymen worden gevonden
Restrictie-enzymen worden aangetroffen in veel verschillende bacteriestammen, waar hun biologische rol het deelnemen aan celverdediging is. Deze enzymen beperken vreemd (viraal) DNA dat de cellen binnenkomt door ze te vernietigen. De gastheercellen hebben een restrictie-modificatiesysteem dat hun eigen DNA methyleert op plaatsen die specifiek zijn voor hun respectieve restrictie-enzymen, waardoor ze worden beschermd tegen splitsing. Meer dan 800 bekende enzymen zijn ontdekt die meer dan 100 verschillende nucleotidesequenties herkennen.
Soorten restrictie-enzymen
Er zijn vijf verschillende soorten restrictie-enzymen. Type I snijdt DNA op willekeurige locaties tot wel 1000 of meer basenparen van de herkenningsplaats. Type III snijdt op ongeveer 25 basenparen van de locatie. Beide typen hebben ATP nodig en kunnen grote enzymen zijn met meerdere subeenheden. Type II-enzymen, die voornamelijk worden gebruikt in de biotechnologie, snijden DNA binnen de herkende sequentie zonder dat ATP nodig is en zijn kleiner en eenvoudiger.
Type II-restrictie-enzymen worden genoemd naar de bacteriesoort waarvan ze zijn geïsoleerd. Het enzym EcoRI werd bijvoorbeeld geïsoleerd uit E. coli. Het merendeel van het publiek is bekend met E. coli-uitbraken in voedsel.
Type II-restrictie-enzymen kunnen twee verschillende soorten snijwonden genereren, afhankelijk van of ze beide snijden strengen in het midden van de herkenningsreeks of elke streng dichter bij één uiteinde van de herkenning volgorde.
De eerste snede genereert "stompe uiteinden" zonder overhangende nucleotiden. Deze laatste genereert "plakkerige" of "samenhangende" uiteinden omdat elk resulterend DNA-fragment een overhang heeft die de andere fragmenten aanvult. Beide zijn nuttig bij het maken van moleculaire genetica recombinant DNA en eiwitten. Deze vorm van DNA valt op omdat het wordt geproduceerd door de ligatie (aan elkaar binden) van twee of meer verschillende strengen die oorspronkelijk niet met elkaar waren verbonden.
Type IV-enzymen herkennen gemethyleerd DNA en Type V-enzymen gebruiken RNA's om sequenties te snijden op binnendringende organismen die niet palindroom zijn.
Gebruik in biotechnologie
Restrictie-enzymen worden in de biotechnologie gebruikt om DNA in kleinere strengen te knippen om verschillen in fragmentlengte tussen individuen te bestuderen. Dit wordt aangeduid als polymorfisme met restrictiefragmentlengte (RFLP). Ze worden ook gebruikt voor het klonen van genen.
RFLP-technieken zijn gebruikt om te bepalen dat individuen of groepen individuen onderscheidende verschillen hebben in gensequenties en restrictiesplitsingspatronen in bepaalde gebieden van het genoom. Kennis van deze unieke gebieden is de basis voor DNA-vingerafdrukken. Elk van deze methoden is afhankelijk van het gebruik van agarosegel-elektroforese voor de scheiding van de DNA-fragmenten. TBE-buffer, die bestaat uit Tris-base, boorzuur en EDTA, wordt vaak gebruikt voor agarosegel elektroforese om DNA-producten te onderzoeken.
Gebruik bij klonen
Klonen vereist vaak het inbrengen van een gen in een plasmide, een soort DNA-stuk. Restrictie-enzymen kunnen helpen bij het proces vanwege de enkelstrengige overhangen die ze achterlaten als ze snijden. DNA-ligase, een afzonderlijk enzym, kan twee DNA-moleculen met bijpassende uiteinden met elkaar verbinden.
Door restrictie-enzymen te gebruiken met DNA-ligase-enzymen, kunnen stukjes DNA uit verschillende bronnen worden gebruikt om een enkel DNA-molecuul te maken.