Hoe snijden restrictie-enzymen DNA-sequenties?

In de natuur, organismen moeten zichzelf constant beschermen tegen vreemde indringers, zelfs op microscopisch niveau. In bacteriën is er een groep bacteriële enzymen die werken door vreemde stoffen te ontmantelen DNA. Dit ontmantelingsproces wordt restrictie genoemd en de enzymen die dit proces uitvoeren worden restrictie-enzymen genoemd.

Restrictie-enzymen zijn erg belangrijk in recombinant DNA-technologie. Restrictie-enzymen zijn gebruikt om vaccins, farmaceutische producten, insectenbestendige gewassen en tal van andere producten te produceren.

Belangrijkste leerpunten

Restrictie-enzymen zijn een klasse van enzymen die DNA in fragmenten knippen op basis van het herkennen van een specifieke sequentie van nucleotiden. Restrictie-enzymen staan ​​ook bekend als restrictie-endonucleasen.

Hoewel er honderden verschillende restrictie-enzymen zijn, werken ze allemaal op dezelfde manier. Elk enzym heeft een zogenaamde herkenningssequentie of site. Een herkenningsreeks is typisch een specifieke, korte nucleotide sequentie in DNA. De enzymen snijden op bepaalde punten binnen de herkende volgorde. Een restrictie-enzym kan bijvoorbeeld een specifieke sequentie van guanine, adenine, adenine, thymine, thymine, cytosine herkennen. Wanneer deze sequentie aanwezig is, kan het enzym in de sequentie verspringende sneden maken in de suiker-fosfaatruggengraat.

Maar als restrictie-enzymen knippen op basis van een bepaalde sequentie, hoe beschermen cellen zoals bacteriën hun eigen DNA dan om te worden gesneden door restrictie-enzymen? In een typische cel, methylgroepen (CH₃) worden toegevoegd aan de basen in de sequentie om herkenning door de restrictie-enzymen te voorkomen. Dit proces wordt uitgevoerd door complementaire enzymen die dezelfde sequentie van nucleotidebasen herkennen als restrictie-enzymen. De methylering van DNA staat bekend als modificatie. Met de modificatie- en restrictieprocessen kunnen cellen zowel vreemd DNA dat een gevaar voor de cel vormt, doorknippen terwijl het belangrijke DNA van de cel behouden blijft.

Gebaseerd op de dubbelstrengs configuratie van DNA, zijn herkenningssequenties symmetrisch op de verschillende stands, maar lopen in tegengestelde richtingen. Bedenk dat DNA een "richting" heeft die wordt aangegeven door het type koolstof aan het einde van de streng. Aan het 5'-uiteinde is een fosfaatgroep bevestigd, terwijl aan het andere 3'-uiteinde een hydroxylgroep is bevestigd. Bijvoorbeeld:

5 'einde -... guanine, adenine, adenine, thymine, thymine, cytosine... - 3 'einde

3 'einde -... cytosine, thymine, thymine, adenine, adenine, guanine... - 5 'einde

Als bijvoorbeeld het restrictie-enzym binnen de sequentie tussen de guanine en adenine snijdt, dan is het zou dit doen met beide reeksen maar aan tegenovergestelde uiteinden (aangezien de tweede reeks in het tegenovergestelde loopt richting). Omdat het DNA op beide strengen wordt doorgesneden, zullen er complementaire uiteinden zijn die waterstof aan elkaar kunnen binden. Deze uiteinden worden vaak 'plakkerige uiteinden' genoemd.

De plakkerige uiteinden van de fragmenten die door restrictie-enzymen worden geproduceerd, zijn nuttig in een laboratoriumomgeving. Ze kunnen worden gebruikt om DNA-fragmenten van verschillende bronnen en van verschillende organismen samen te voegen. De fragmenten worden bij elkaar gehouden door waterstofbruggen. Chemisch gezien zijn waterstofbruggen zwakke attracties en niet permanent. Met een ander type enzym kunnen de bindingen echter permanent worden gemaakt.

DNA-ligase is een zeer belangrijk enzym dat in zowel de replicatie en reparatie van het DNA van een cel. Het werkt door het samenbrengen van DNA-strengen te helpen. Het werkt door een fosfodiësterbinding te katalyseren. Deze band is een covalente binding, veel sterker dan de bovengenoemde waterstofbrug en in staat om de verschillende fragmenten bij elkaar te houden. Wanneer verschillende bronnen worden gebruikt, heeft het resulterende recombinante DNA dat wordt geproduceerd een nieuwe combinatie van genen.

Er zijn vier brede categorieën van restrictie-enzymen: Type I-enzymen, Type II-enzymen, Type III-enzymen en Type IV-enzymen. Ze hebben allemaal dezelfde basisfunctie, maar de verschillende typen worden geclassificeerd op basis van hun herkenning volgorde, hoe ze klieven, hun samenstelling en op hun stofvereisten (de behoefte aan en het type cofactoren). In het algemeen knippen Type I-enzymen DNA op plaatsen die ver verwijderd zijn van de herkenningssequentie; Type II sneed DNA binnen of dichtbij de herkenningssequentie; Type III gesneden DNA-sequenties voor bijna-herkenning; en Type IV splitsen gemethyleerd DNA.

• Biolabs, New England. "Soorten restrictie-endonucleasen." New England Biolabs: reagentia voor de life sciences-industrie, www.neb.com/products/restriction-endonucleases/restriction-endonucleases/types-of-restriction-endonucleases.
• Reece, Jane B. en Neil A. Campbell. Campbell Biology. Benjamin Cummings, 2011.